Guangzhou Dongsheng Biotech Co., Ltd
Professional molecular diagnostics, serving the world.
Add to Cart
RT - набор PCR
Для пользы исследования только
Но. R1011 кота, 20 rxns
Но. R1012 кота, 100 rxns
Компоненты набора
| Компонент | R1011 (20 rxns) | R1012 (100 rxns) |
| M-MLV (200U/μl) | μl 20 | μl 100 |
| RNasin (40U/μl) | μl 12 | μl 60 |
| Oligo (dT) 15 (50μM) | μl 20 | μl 100 |
| Случайный праймер hexamer (50μM) | μl 20 | μl 100 |
| буфер Перво-стренги 5× | μl 80 | μl 400 |
| свободное от РНКаз ddH2 o | 1 ml | 1 ml × 5 |
| dNTPs (10mM по каждому) | μl 50 | μl 250 |
Хранение
Все компоненты набора следует сохранить на -20°C. держат РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ контроля на -70°C для более длинного хранения.
Описание
Набор RT-PCR оптимизирован для того чтобы синтезировать cDNA перво-стренги от очищенное поли (a) + или полной РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. Набор RT-PCR для RT-PCR поставляет увеличенные выходы cDNA, высокую чувствительность, и без сокращений транскрипты в удобном формате. Вы получаете все компоненты вам для успешного синтеза cDNA перво-стренги, сохраняющ ваше время и обеспечивающ ваш успех с каждым экспериментом. Набор обратное Transcriptase версия M-MLV RT которое было проектировано для уменьшения деятельности при h рНКазы и для того чтобы обеспечить увеличенную термическую стабильность. Энзим использован для того чтобы синтезировать cDNA на диапазон температур 42-55°C, обеспечивая увеличенную характерность, более высокие выходы cDNA, и более без сокращений продукт чем другие обратные transcriptases.
Применения
Первый синтез cDNA стренги для RT-PCR
Конструкция библиотек cDNA
Одношаговое RT-PCR
Расширение праймера
Важные примечания
Избежание загрязнения рибонуклеазы
Очищенность и целостность РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ необходимы для синтеза без сокращений cDNA. РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА может быть ухудшена рНКазой a, которая сильно стабилизированный загрязняющий елемент найденный в любой окружающей среде лаборатории. Все компоненты набора rigorously были испытаны для обеспечения что они свободны от РНКаз. Предотвратить загрязнение и окружающая среда и реагенты лаборатории, все подготовленные решения должны быть свободны RNases. Общие рекомендации избежать загрязнения рНКазы:
РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА шаблона
Полная клетчатая РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА изолированная стандартными методами соответствующая для пользы с набором. Очищенная РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА должна быть свободна солей, ионов металла, этанола и фенола, который нужно избежать заблокировать реакцию синтеза cDNA. Загрязняющие елементы трассировки могут извлечься высыпанием этанола РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ следовать 2 мыть лепешки с холодным этанолом 75%. Для применений RT-PCR, РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА шаблона должна быть свободна загрязнения ДНК. До синтеза cDNA, РИБОНУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ можно обработать с DNase i для того чтобы извлечь ничтожные количества ДНК. DNase я должен быть получен потребителем. Всегда выполняйте реакцию контроля (RT-минус) которая включает все компоненты для RT-PCR за исключением обратного энзима transcriptase.
Пищеварение h рНКазы
Чувствительность шага PCR может быть увеличена (особенно для длинных шаблонов) путем извлекать шаблон РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ из cDNA: Молекула РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ гибридная пищеварением с рНКазой h после синтеза перво-стренги. Присутсвие рНКазы h во время синтеза перво-стренги ухудшит шаблон mRNA, приводящ в уменьшенном без сокращений синтезе cDNA и уменьшенных выходах cDNA перво-стренги.
Праймеры
Синтез первого cDNA стренги можно воспламенить с или oligo (dT) праймером 15, случайными праймерами или Джин-специфическими праймерами.
Oligo (dT) 15 воспламеняют синтез cDNA от поли настоящего момента кабеля (a) на 3' - конец eukaryotic mRNA. Случайные праймеры начинают синтез cDNA от полного населения РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (rRNA и mRNA). Поэтому, используя случайные праймеры для первых результатов синтеза стренги в большей сложности произведенного cDNA сравненного с oligo (dT) праймером 15. Как следствие, чувствительность и характерность последующих реакций PCR могут быть уменьшены. Однако, несколько применений где полезно использовать случайные праймеры, как синтез cDNA используя mRNAs без поли кабеля (a), или синтез cDNA используя поли (a) - обогащенные образцы РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ.
Джин-специфические праймеры использованы для того чтобы синтезировать специфическое cDNA от бассейна полных РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ или mRNA и должны быть получены потребителем.
Перво- процедура по синтеза cDNA стренги
Перво- реакцию cDNA стренги можно выполнить как индивидуальная реакция или как серия параллельных реакций с различными шаблонами РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ. Поэтому, смесь реакции может быть подготовлена путем совмещение реагентов индивидуальное или мастерское смешивание содержа все компоненты за исключением РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ шаблона можно подготовить. В зависимости от структуры шаблона РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, отдельные шаги для denaturation РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ и отжиг праймера могут улучшить результаты RT-PCR.
Протокол
I. Первый синтез cDNA стренги
1. Добавьте следующие реагенты в стерильную, свободную от нуклеиназ трубку на льде в показанном заказе:
| РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА шаблона |
поли (a) mRNA или специфическая РИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА |
1-5 μg |
| Праймер |
oligo (dT) праймер 15 или случайный праймер hexamer |
1 μl 1 μl |
| DEPC-обработанная вода | к μl 12,4 | |
| Полный том | μl 12,4 | |
2. Смешайте нежно, центрифугуйте кратко и инкубируйте на 70°C на 5 MIN. холодка на льде, закрутить вниз и установить пробирку назад на льде.
3. Подготовьте следующее смешивание синтеза cDNA, добавьте следующие компоненты в показанном заказе:
| буфер перво-стренги 5× | μl 4 |
| dNTPs (10 mM каждое) | 1 μl |
| RNasin | 0,6 μl |
| M-MLV | 1 μl |
4. Смешайте нежно и центрифугуйте кратко.
5. Для oligo (dT) 15, инкубируйте на минута 60 на 42°C. Для случайного hexamer воспламененный синтез, инкубирует на минута 60 на 37°C.
6. Прекратите реакцию путем нагревать на 70°C на 5 MIN.
Обратный продукт реакции транскрипции можно использовать немедленно во вторых реакциях синтеза cDNA стренги или хранить на -20°C для чем неделю. Для более длинного хранения, -70°C порекомендовано.
II. амплификация PCR первого cDNA стренги
Продукт первого синтеза cDNA стренги можно использовать сразу в PCR или qPCR. Том первой смеси реакции синтеза cDNA стренги не должен состоять из больше чем 1/10 из полного тома реакции PCR. Нормально, μl 2 первой смеси реакции синтеза cDNA стренги использовано как шаблон для последующего PCR в томе 50 μl полном.
Dongsheng Biotech предлагает различную серию продуктов для того чтобы помочь вам достигнуть успеха PCR. Для энзимов, наша полимераза Taq, полимераза ДНК HS Taq, полимераза ДНК полимеразы, Pfu ДНК FS Taq и полимераза ДНК Pfu сплавливания обеспечивают высококачественное, эффективный, представление PCR чувствительности. Мы также имеем длинную полимеразу ДНК Taq для длинного представления PCR.